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鸽痘病毒荧光定量PCR试剂盒(染料法)图片
产品货号:
BTN14-74200
中文名称:
鸽痘病毒荧光定量PCR试剂盒(染料法)
英文名称:
Pigeon Pox Virus(PPV) SYBR qPCR Kit
产品规格:
50次
发货周期:
1~3天
产品价格:
询价
本公司开发了简单快捷的鸽痘病毒染料法荧光定量PCR检测试剂盒。


鸽痘病毒(Pigeon Pox Virus,PPV)会引起鸽痘,多发生于幼鸽,每年3~6月为主流行季,其他季节亦会感染,对未接种疫苗的赛鸽构成严重威胁。这种病毒主要由呼吸道飞沫和皮肤接触传染。病毒进入鸽子体内后即快速大量繁殖,潜伏期4~7天,然后在皮肤及粘膜处爆发,如鼻部、嘴缘、口腔、眼睛周围、肛门口、脚部及体表其他不长毛的部位,严重时眼球及气管内亦会感染,影响赛鸽的体能及呼吸,亦常并发细菌感染或毛滴虫、球虫、呼吸道疾病发作,甚至造成死亡。该病毒会对养殖业造成较大的经济损失,因此鸽痘病毒的快速准确鉴定对该病的预防和检疫有着重要作用,


  1. 即开即用,用户只需要提供病毒样品。
  2. 根据鸽痘病毒保守序列设计的专一性引物,与相关病毒无交叉反应。
  3. 灵敏度可以达到几百拷贝/反应。
  4. 一管式荧光定量PCR检测,避免后续污染。
  5. 本试剂盒足够50次20μL反应体系的荧光定量PCR。
  6. 本产品只适用于科研,不能用于临床诊断。



组分规格
2×qPCR MagicMix500μL
荧光PCR专用模板稀释液1mL
鸽痘病毒PCR引物混合物100μL
鸽痘病毒PCR阳性对照(1×108拷贝/μL)50μL

保存:-20℃,有效期一年。


一、稀释PCR阳性对照(以102~107拷贝/μL这6个10倍稀释度为例)注意:由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行,千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原,本产品不提供活体样品做阳性对照,只提供可以直接使用的DNA片段作为阳性对照。
  1. 标记6个离心管,分别为7,6,5,4,3,2。
  2. 用带芯枪头分别加入45μL荧光PCR专用模板稀释液(最好用带芯枪头,下同)。
  3. 在7号管中加入5μL 1×108拷贝/μL的阳性对照,充分震荡1分钟,得1×107拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
  4. 换枪头,在6号管中加入5μL 1×107拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡1分钟,得1×106拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
  5. 换枪头,在5号管中加入5μL 1×106拷贝/μL的阳性对照到5号管中,充分震荡1分钟,得1×105拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
  6. 重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。


二、样品DNA的制备
  1. 如果有N个样品,必须设置N+2个提取,多出的一个是PC(样品制备阳性对照),一个是NC(样品制备阴性对照)。可以用10μL上步制备的PCR阳性对照的第4号(浓度为1×104拷贝/μL,10μL相当于1万拷贝)或第5号(浓度为1×105拷贝/μL,10μL相当于10万拷贝)再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样,以此作为PC。另外用水作为NC。如果每次制备需要200μL样品,则PC和NC的体积也必须是200μL。
  2. 用自选方法纯化样品的DNA,本试剂盒跟市场上大多数病毒DNA提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的一管式病毒DNA提取试剂盒或其升级版柱式病毒DNA提取试剂盒。本试剂盒免费赠送15次一管式病毒DNA提取试剂盒,其使用手册可从本公司网站www.bjbalb.com通过搜索产品名称一管式病毒DNA提取试剂盒或产品货号BTN3674下载。


三、设置qPCR反应(20μL体系,在样品制备室进行)
  1. 如果只做1次重复,则标记N+9个PCR管,其中N+2个用于上步得到的N+2个样品,1个用于PCR阴性对照,6个用于PCR阳性对照。如果做2~3次重复,则反应设置数量相应增加2或3倍。
  2. 在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照,并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加):
    成分样品管
    N+2个
    PCR阴性
    对照管
    PCR阳性对照管
    (2~7管)
    2×qPCR MagicMix10μL10μL各10μL
    鸽痘病毒PCR引物混合液2μL2μL各2μL
    自备10×ROX(见注)2μL2μL各2μL
    N+2待测样品DNA模板6μL不加不加
    第7步所得PCR阳性对照稀释液(2~7号)不加不加各6μL
    注:仅ABI7500、7700和7900仪器需要使用ROX作为对照,其他荧光PCR仪器(如iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene3000、RotorGene 6000和LightCycler480)不需要使用ROX,则用水替代。
  3. 盖上盖子后上机,按下面参数进行PCR(具体PCR参数可以根据仪器不同而自行优化)。
    过程温度时间
    预变性92℃5分钟
    PCR反应
    (30个循环)
    94℃60秒
    54℃60秒
    76℃60秒


  4. 数据采集具体操作按所用仪器推荐的流程进行。本产品中所含的荧光染料在不结合DNA时,最大吸收光谱在471nm,结合DNA时的最大吸收光谱在500nm,最大发射光谱在530nm。信号采集可以设置在复性或延伸步骤。


四、数据处理
  1. 如果把本试剂盒用于定量检测,则以阳性对照浓度的log值为横轴,以Ct值为纵轴,绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值,再推算出其浓度。
  2. 如果把本试剂盒用于定性检测,只判断阳性或阴性,则阴性对照Ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长,有典型扩增曲线,Ct值应该小于或等于30。对待测样品,如果其Ct大于或等于40则为阴性,如果小于或等于35则为阳性。如果在35~40之间,则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性,如果小于40,则为阳性。




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